木材光顯樣本製備技術
一般製備步驟
製作一般光顯用之木材組織切片時所需步驟包括:木材軟化與保存、切片、脫水、染色、封片等步驟。
(一)木材軟化:
由於木材較為堅硬,所以要進行切片之前必須先將木材軟化之後方可切片。一般會依木材之三切面切成小方塊(約 1×1×4.0 ㎝3)後,置於沸水中煮沸以排除木塊中的氣體直至木塊沉入水底後,至此,大部份中低比重之材種(約0.5以下者)即可進行切片;但較高比重者可再進行後續軟化工作。一般使用甘油(glycerol)作為軟化劑,將完成排氣的木塊置於無蓋的器皿中,倒入濃度10%的甘油水溶液,放在40℃的烘箱中加熱至水分完全蒸發為止,即完成木材之軟化,此約需7~10天。
除了上述方法,亦有其他的木材軟化方法。
(1)Brook等(1966)使用濃度15~50%不等的氫氟酸(hydrofluoric acid, HF)水溶液當作木材軟化劑,得到結果並建議:闊葉材以60%氫氟酸水溶液浸泡3~4天;針葉材以60%氫氟酸水溶液浸泡3~4天後,以清水淋洗2~3天後即完成軟化。
(2)Kukachka(1977)使用4%的乙烯二胺(ethylenediamine)水溶液當作軟化劑,比重低至中之闊葉材(能浮在水中者)於室溫下浸泡於軟化劑中並抽真空12-16小時;比重大者(沉在水底者)則需24-36小時。完成上述步驟後取出木塊放到新的軟化劑中加熱至70~75℃中維持15-30分鐘,即可以切片機切片。
(二)保存:
軟化完成之木材亦會產生發霉或真菌、細菌危害,為避免上述情形,會將木材浸泡於50%之甘油-酒精溶液中,添加酒精可產生殺菌效果,但亦會使木材產生硬化,所以保存溶液中亦需含有甘油以維持木材之鬆軟度。
(三)切片:
A.徒手切片:
徒手切片是最簡單的切片方法,此即一手拿著銳利的新刀片(包含專用之切片刀、或是一般剃刀),刀片先沾一點水(避免切皺縮),另一手以拇指及食指握緊材料,以持刀之手保持水平切下試片(切過的刀鋒不可再使用),準備一器皿盛水,以滴管將切下之試片沖洗漂浮在水面,再挑選出厚薄適中者置於載玻片上,先以顯微鏡觀察切片良好與否,判斷之方法包括切片是否厚薄不均、切片是否破碎、是否有想觀察之組織等,若符合需求則可進行後續工作。
B.切片機切片:
切片機可分為滑動式切片機(sliding microtome)以及轉動式切片機(rotary microtome)二類。但一般以滑動式切片機較為常用。使用時,將試材固定於夾具上鎖緊,欲觀察之切面面向刀口,準備一廣口淺碟形容器盛50%酒精水溶液(水亦可),再準備一枝毛筆。
一隻手拉動軌道上的切片刀即可切下試片,同時另一隻手須拿著以甘油或水濕潤過的毛筆以備隨時將捲曲的切片展平。切下的切片可直接以毛筆輕輕展移到盛水的容器中,再以鑷子移到載玻片上即可;若切片容易捲曲,可先將切片先以毛筆輕輕撫壓後置於刀面上數分鐘,藉甘油之張力將切片展開定形後,再移到載玻片上。
C.脫水染色:
染色(staining)是將切片浸泡於染色液中,讓組織與染料結合併產生著色(註2),如此可增強組織在顯微鏡下的對比效果,方便觀察與拍攝。
染料依化學性質不同可分為鹼性染料(basic dye)與酸性染料(acid dye);依來源可分為天然染料(natural dye)或綜合染料(synthetic dye)。鹼性染料帶正電荷,可染上組織細胞內帶負電荷(酸性)的部分,如染色體、核仁、木質部等;酸性染料則帶負電荷,可與細胞內帶正電荷之處結合,如細胞質、纖維素等。
染料的選擇與染色技術,與欲觀察之組織、顯微鏡之種類及光源均有關,如木質化的細胞壁對番紅(Safranin-O)的親合力較強,韌皮部對速綠(fast green)的親和力較強,藉此雙重染色可得到紅綠不同之明顯對比;若使用偏光顯微鏡(polarizing microscope)則其本身之偏光透鏡即可產生不同色彩對比之偏光效果,若採用螢光顯微鏡(fluorescent microscope)則需使用螢光劑進行染色。
一般觀察木材切片時可單用番紅或以番紅與速綠進行搭配染色即可得到良好之觀察效果。因此在此介紹番紅-速綠雙重染色法。
1. 切片浸泡於0.5% Safranin之50%酒精溶液------------------3小時至過夜
2. 50%酒精沖洗-------------------------------------------------------3次
3. 70%酒精浸泡-------------------------------------------------------10分鐘
4. 85%酒精浸泡-------------------------------------------------------10分鐘
5. 95%酒精浸泡-------------------------------------------------------10分鐘
6. 0.1%fast green酒精溶液------------------------------------------3分鐘(註3)
7. 95%酒精沖洗-------------------------------------------------------3次
8. 脫水酒精-------------------------------------------------------------5分鐘
9. 脫水酒精-------------------------------------------------------------5分鐘
10. 脫水酒精 + 二甲苯 (1:1)----------------------------------------10分鐘
11. 二甲苯---------------------------------------------------------------10分鐘(註4)
D.封片:
使用膠料將切片固定於載玻片與蓋玻片中,即為封片(sealing, mounting)。依照製作目的不同可將封片區分為暫時性封片和永久性封片。
如為短暫觀察之用,切片不需保存,常採用暫時封片方式進行之。將切片小心移至載玻片上後滴上1滴水展平切片,以45°角輕放下蓋玻片,蓋下時盡量避免氣泡即可。若擔心時間過長切片發霉,可以50/50之甘油-酒精混和溶液替代水溶液,滴入1至數滴福馬林,再以指甲油固定蓋玻片即可。
若切片需要長期保存時,則需採用永久封片法,步驟如下:
1. 以稀釋的清潔劑清洗載玻片及蓋玻片,放在烘箱中烘乾。
2. 滴1~2滴巴爾森膠(balsam)或其他封片膠在載玻片上;過少發生欠膠,產生空隙;過多則膠會溢出,不易清理。
3. 以毛筆將切片自二甲苯中取出,展平於玻片之巴爾森膠上,再滴上1滴巴爾森膠,迅速將蓋玻片蓋上。
4. 於載玻片上貼上標籤貼紙,註明樹種學名、製作日期、製作者即完成封片。
製作一般光顯用之木材組織切片時所需步驟包括:木材軟化與保存、切片、脫水、染色、封片等步驟。
(一)木材軟化:
由於木材較為堅硬,所以要進行切片之前必須先將木材軟化之後方可切片。一般會依木材之三切面切成小方塊(約 1×1×4.0 ㎝3)後,置於沸水中煮沸以排除木塊中的氣體直至木塊沉入水底後,至此,大部份中低比重之材種(約0.5以下者)即可進行切片;但較高比重者可再進行後續軟化工作。一般使用甘油(glycerol)作為軟化劑,將完成排氣的木塊置於無蓋的器皿中,倒入濃度10%的甘油水溶液,放在40℃的烘箱中加熱至水分完全蒸發為止,即完成木材之軟化,此約需7~10天。
除了上述方法,亦有其他的木材軟化方法。
(1)Brook等(1966)使用濃度15~50%不等的氫氟酸(hydrofluoric acid, HF)水溶液當作木材軟化劑,得到結果並建議:闊葉材以60%氫氟酸水溶液浸泡3~4天;針葉材以60%氫氟酸水溶液浸泡3~4天後,以清水淋洗2~3天後即完成軟化。
(2)Kukachka(1977)使用4%的乙烯二胺(ethylenediamine)水溶液當作軟化劑,比重低至中之闊葉材(能浮在水中者)於室溫下浸泡於軟化劑中並抽真空12-16小時;比重大者(沉在水底者)則需24-36小時。完成上述步驟後取出木塊放到新的軟化劑中加熱至70~75℃中維持15-30分鐘,即可以切片機切片。
(二)保存:
軟化完成之木材亦會產生發霉或真菌、細菌危害,為避免上述情形,會將木材浸泡於50%之甘油-酒精溶液中,添加酒精可產生殺菌效果,但亦會使木材產生硬化,所以保存溶液中亦需含有甘油以維持木材之鬆軟度。
(三)切片:
A.徒手切片:
徒手切片是最簡單的切片方法,此即一手拿著銳利的新刀片(包含專用之切片刀、或是一般剃刀),刀片先沾一點水(避免切皺縮),另一手以拇指及食指握緊材料,以持刀之手保持水平切下試片(切過的刀鋒不可再使用),準備一器皿盛水,以滴管將切下之試片沖洗漂浮在水面,再挑選出厚薄適中者置於載玻片上,先以顯微鏡觀察切片良好與否,判斷之方法包括切片是否厚薄不均、切片是否破碎、是否有想觀察之組織等,若符合需求則可進行後續工作。
B.切片機切片:
切片機可分為滑動式切片機(sliding microtome)以及轉動式切片機(rotary microtome)二類。但一般以滑動式切片機較為常用。使用時,將試材固定於夾具上鎖緊,欲觀察之切面面向刀口,準備一廣口淺碟形容器盛50%酒精水溶液(水亦可),再準備一枝毛筆。
一隻手拉動軌道上的切片刀即可切下試片,同時另一隻手須拿著以甘油或水濕潤過的毛筆以備隨時將捲曲的切片展平。切下的切片可直接以毛筆輕輕展移到盛水的容器中,再以鑷子移到載玻片上即可;若切片容易捲曲,可先將切片先以毛筆輕輕撫壓後置於刀面上數分鐘,藉甘油之張力將切片展開定形後,再移到載玻片上。
C.脫水染色:
染色(staining)是將切片浸泡於染色液中,讓組織與染料結合併產生著色(註2),如此可增強組織在顯微鏡下的對比效果,方便觀察與拍攝。
染料依化學性質不同可分為鹼性染料(basic dye)與酸性染料(acid dye);依來源可分為天然染料(natural dye)或綜合染料(synthetic dye)。鹼性染料帶正電荷,可染上組織細胞內帶負電荷(酸性)的部分,如染色體、核仁、木質部等;酸性染料則帶負電荷,可與細胞內帶正電荷之處結合,如細胞質、纖維素等。
染料的選擇與染色技術,與欲觀察之組織、顯微鏡之種類及光源均有關,如木質化的細胞壁對番紅(Safranin-O)的親合力較強,韌皮部對速綠(fast green)的親和力較強,藉此雙重染色可得到紅綠不同之明顯對比;若使用偏光顯微鏡(polarizing microscope)則其本身之偏光透鏡即可產生不同色彩對比之偏光效果,若採用螢光顯微鏡(fluorescent microscope)則需使用螢光劑進行染色。
一般觀察木材切片時可單用番紅或以番紅與速綠進行搭配染色即可得到良好之觀察效果。因此在此介紹番紅-速綠雙重染色法。
1. 切片浸泡於0.5% Safranin之50%酒精溶液------------------3小時至過夜
2. 50%酒精沖洗-------------------------------------------------------3次
3. 70%酒精浸泡-------------------------------------------------------10分鐘
4. 85%酒精浸泡-------------------------------------------------------10分鐘
5. 95%酒精浸泡-------------------------------------------------------10分鐘
6. 0.1%fast green酒精溶液------------------------------------------3分鐘(註3)
7. 95%酒精沖洗-------------------------------------------------------3次
8. 脫水酒精-------------------------------------------------------------5分鐘
9. 脫水酒精-------------------------------------------------------------5分鐘
10. 脫水酒精 + 二甲苯 (1:1)----------------------------------------10分鐘
11. 二甲苯---------------------------------------------------------------10分鐘(註4)
D.封片:
使用膠料將切片固定於載玻片與蓋玻片中,即為封片(sealing, mounting)。依照製作目的不同可將封片區分為暫時性封片和永久性封片。
如為短暫觀察之用,切片不需保存,常採用暫時封片方式進行之。將切片小心移至載玻片上後滴上1滴水展平切片,以45°角輕放下蓋玻片,蓋下時盡量避免氣泡即可。若擔心時間過長切片發霉,可以50/50之甘油-酒精混和溶液替代水溶液,滴入1至數滴福馬林,再以指甲油固定蓋玻片即可。
若切片需要長期保存時,則需採用永久封片法,步驟如下:
1. 以稀釋的清潔劑清洗載玻片及蓋玻片,放在烘箱中烘乾。
2. 滴1~2滴巴爾森膠(balsam)或其他封片膠在載玻片上;過少發生欠膠,產生空隙;過多則膠會溢出,不易清理。
3. 以毛筆將切片自二甲苯中取出,展平於玻片之巴爾森膠上,再滴上1滴巴爾森膠,迅速將蓋玻片蓋上。
4. 於載玻片上貼上標籤貼紙,註明樹種學名、製作日期、製作者即完成封片。